ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer zu verkaufen - DNA Sequencer mit neuem Laser, Garantie, Installation und Service

Technische Daten ABI 310

Übersicht:

Der ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer ist ein Einkapillarsequencer zur vollautomatischen Abarbeitung von 48 oder 96 Einzelproben. Heute verwendete unbeschichtete Glaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 50µm eignen sich mit den Fertigpolymeren POP-4 (POP® = Performance Optimised Polymer) und 36cm Trennstrecke für schnelle Fragmentanalyse-Läufe und Sequenzierungen bis 300bp sowie mit dem Polymer POP-6 und 36cm bzw. 50cm Trennstrecke für Sequenzierungen bis 500 bzw. 600bp sowie nach Erweiterung der Sequencersoftware auch mit dem Polymer POP-7 und 36cm Trennstrecke für noch schnellere Fragmentanalyse-Läufe und Sequenzierungen bis 500bp bzw. mit 50cm Trennstrecke und niedriger Laufspannug für Sequenzierungen bis 800bp. Die kontinuierliche Detektion der Fluoreszenzfarbstoff-markierten Fragmente erfolgt durch Anregung der Farbstoffe über einen fokussierten 505nm Dioden oder Multi-Line Argon-Ionen-Laser und die Auswertung der Emission nach spektraler Aufspaltung an einem Beugungsgitter über eine hochauflösende CCD Kamera. Mit Hilfe der anwendungsspezifischen Auswertesoftware werden die detektierten Emissionspeaks in eine Sequenzabfolge (Basecalling) übersetzt oder an Hand eines inter mitgeführten Längenstandards tabellarisch als errechnete Fragmentlängen in bp ausgegeben (Sizecalling). Optional werden die Fragmente auch automatisch als vorab definierte Allele interpretiert (Genotyping / Allelcalling).

Haupt-
merkmale:

Kapillarelektrophorese (engl. CE = capillary electrophoresis) Sequencer mit einer Kapillare und Auftrennstrecken von 36cm (Gesamtlänge der Kapillare 47cm) oder 50cm (Gesamtlänge 61cm)
Autosamplerträger für 48 Proben in 0,5ml Einzeltubes (optional mit Gummiseptadeckel verschlossen) oder 96 Proben in 0,2ml Einzeltubes oder 12er-Tubestreifen (mit gemeinsamer 2x12er Gummiseptamatte verschlossen)
10mW MultiLine Argon-Ionen-Laser (JDS Uniphase 2212-10MLMA) mit den Hauptwellenlängen 488nm (blau) und 514,5nm (blau-grün), den wir seit 2022 durch einen eigenentwickelten 505nm LED Dioden-Laser ersetzt haben
Virtuelle Filter für 4 oder 5 Farbkanäle zur Messung von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Fragmenten im Emissionsbereich von 520 bis 700nm
Auftrennung von Fragmenten zwischen 10 und ca. 1.000bp
Elektrophoresespannung 100V bis 15kV, Spannung und Strom werden während eines Laufs protokolliert
Geregelte Kapillarheizung mit einem Temperaturbereich 10°C über RT bis 70°C,typischerweise 50°C für Sequenzierungen bzw. 60°C für Fragmentanalysen
Trennmedium POP-4, POP-6 und mit Softwaremodifikationen auch POP-7 in der 1ml Glasvorratsspritze (Kloehn, Hamilton oder ILS) mit automatischer Neubefüllung der Kapillare vor jedem Lauf
Laufzeiten ca. 15 bis 150 Minuten, je nach Anforderung an Auftrennleistung und Leseweite - Fragmentanalyseläufe typisch 30 Minuten, Sequenzierläufe typisch 60 Minuten

MAC / PC / Software:

Apple Macintosh G3 oder G4 Rechner mit ausreichend Hauptspeicher, großer Festplatte, serielle RS-422 Schnittstelle, USB, und Netzwerkanbindung, MAC OS 8.x oder OS 9.x Deutsch oder Englisch
Windows PC mit ausreichend Hauptspeicher, großer Festplatte, spezielle serielle RS-232 Schnittstelle, USB, Netzwerkanbindung, Micosoft Windows® 2000, Windows® XP, Windows® 7, Windows® 10 und Windows® 11
ABI 310 Data Collection Software v1.x und v2.0 mit 4 Farbkanälen für MAC OS, v2.1 mit 5 Farbkanälen für MAC OS, v3.0 / v3.1 mit 5 Farbkanälen für Windows® 2000 / XP / 7 / 10 / 11
Sequencing Analysis Software zum Identifizieren der Basenabfolge bis v3.4 für MAC OS, v3.7 für Windows® 2000, v5.x bis v7.0 für Windows® XP bis 11 jeweils mit dem aktuellen KB basecaller (Kilo Base basecaller) zur Angabe der Quality Value Werte entsprechend der Sicherheit der identifizierten Basenabfolge
GeneScan zur Größenbestimmung der Fragmentpeaks anhand des internen Größenstandards im 4. oder 5. Farbkanal bis v3.1 für MAC OS und v3.7 für Windows® 2000 / XP / 7 / 10 / 11. GenoTyper bis v2.5 für MAC OS und v3.7 für Windows® 2000 / XP / 7 / 10 / 11 zur Zuordnung der zuvor errechneten Fragmentgrößen in vordefinierte Allele. GeneMapper v3.x bis v6.0 für Windows® 2000 bis 11 zur gleichtzeitigen Größenbestimmung und Allelzuordnung sowie die für die bei der Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks (Forensik, Vaterschaftstest, Verwandschaftsgrade, Artenvielfalt, ...) benutzten Mikrosatellitenmarker optimierte GeneMapper Version ID v3.1 bis ID-X v1.7 unter Windows 2000 bis 11.
ABI 310 Diagnostic Software in verschiedenen Versionen (am MAC oft als Datei mit der Bezeichnung "310 Main" zu finden) zur Diagnose des Status einzelner Gerätekomponenten und hilfreich bei der Fehlersuche. Eigentlich für den Servicetechniker gedacht, können einfache Diagnosefunktionen jedoch auch vom Endanwender ausgeführt werden.

Technische Daten:

Abmessungen: Breite 61cm x Tiefe 56cm x Höhe 85cm. Minimaler Platzbedarf auf der Laborbank: Breite 100cm x Tiefe 60cm x Höhe 85cm. Gewicht: ca. 90kg (2 starke Personen zum Aufstellen)
Elektrischer Anschluß: Sequencer, PC / MAC und TFT Bildschirm über Eurostecker. Absicherung des Sequencers mit Argon-Laser über mindestens 16Ampere träge (Sicherungstyp 16C) oder extra träge (Sicherungstyp 16K) aber nicht unbedingt notwendig einer separaten Leitung von der Elektroverteilung zur Vermeidung von störenden Einflüssen anderer großer Verbraucher im selben Stromkreis; Für ABI 310 Sequencer mit Dioden-Laser genügt jede Laborsteckdose mit beliebiger Absicherung. Unterbrechungsfreie Stromversorgung (USV) zu Absicherung gegen Überspannung und Stromausfälle wird empfohlen in Gebieten mit bekannten Spannungsschwankungen. Elektrische Leistung PC / MAC und TFT ca. 150W, Sequencer mit ausgeschaltetem Argon-Laser ca. 300W, Sequencer im Betrieb mit Argon-Laser ca. 800-1.200W. Geräte mit Dioden-Laser nur ca. 250W im Betrieb. Aktive Klimatisierung wird für kleine Laborräume empfohlen. Zugluft in Sequencernähe und größere Schwankungen in der Umgebungstemperatur müssen - wegen Einfluss auf das Sizecalling - vermieden werden.

Tipps und Tricks

Tipps zum
Sequencer:

Autosampler-Kalibrierung und -Überprüfung: prinzipiell ist es nicht nötig, den Autosampler des ABI 310 bei jedem Wechsel der Kapillare neu zu kalibrieren. So lange die Elektrode im Betrieb und beim Kapillarenwechsel nicht in Ihrer Position verändert wird (sich also weiterhin in geringem Abstand parallel zur Kapillare befindet), wird eine Kalibrierung nach dem Wechsel auf fast identische X-, Y- und Z-Kalibrierungswerte hinaus laufen. Vielmehr empfiehlt es sich, die aktuelle Kalibrierung des hinteren Kalibrierpunktes nur kurz zu überprüfen: Dazu platziert man an der Position 5 des Autosamplers ein 0,5ml Einzeltube OHNE Septadeckel, benutzt die "Autosampler to Position -> 5 -> Execute" Funktion im Manual Control Fenster um die Kapillare über dem Einzeltube mittig zu platzieren, schlägt den aktuell kalibrierten Wert unter "Autosampler Z-max Travel" nach und bewegt dann den Autosampler über den Befehl "Autosampler Up -> ... -> Execute" um genau diese Anzahl an Schritten nach oben. Bei einer guten Kalibrierung stehen anschließend die Enden von Elektrode und Kapillare mittig ca. 0,6 bis 1,0mm über dem Boden des Plastikgefäßes - falls nicht, lohnt sich eine erneute Kalibrierung des Autosamplers.
Kapillarlagerung bei ausgeschaltetem Gerät: neben der häufig eingesetzten Methode, einen Schaumstoffblock oder eine leere Spitzenbox unter den Autosamplerarm zu positionieren, um das hintere Kapillarende bei ausgeschaltetem Sequencer feucht zu halten, gibt es noch zwei alternative Methoden, die Ihnen möglicherweise einfacher erscheinen:
a.) Der Autosamplerarm mit Puffergefäß wird am Boden des Gerätes abgelegt, das lose Kapillarende jedoch von der Elektrode weg gebogen und in ein mit Puffer oder demineralisiertem Wasser gefülltes 0,5ml Einzeltube mit Septadeckel gesteckt.
b.) Der Autosamplerarm mit Puffergefäß wird am Boden des Gerätes abgelegt und das lose Kapillarende nach Lösen des hinteren Klebestreifens auf der Heizplatte tiefer gesetzt und ausreichend weit das Puffergefäß geschoben.
Bei allen Methoden ist jedoch zu beachten, daß die Modifikation VOR dem Einschalten des Sequencers wieder rückgängig gemacht werden muß, damit weder Elektrode noch Kapillare beim Einschalten des Sequencers Schaden nehmen!
Lebensdauer des Argon Lasers und Energieeinsatz optimieren: die Lebensdauer des im ABI 310 verbauten 10mW Argon-Ionen-Lasers (Modell 2212-10MLMA von JDS Uniphase jetzt Lumentum, USA) hängt (mehr als manche Servicetechniker von Thermo Fisher bestätigen wollen) von der tatsächlichen Betriebszeit und weniger vom Alter des Lasers ab. Zudem ist der Verschleiß des Lasers direkt abhängig von der eingestellten Laserleistung. In beiden Bereichen bietet der ABI 310 noch deutlich Einsparpotential - das Sie mit unserer Hilfe nutzen können.
a.) Sequenzier- und Fragmentanalysemodule mit reduzierter Laserleistung: nach unserer Erfahrung wird die Sensitivität des ABI 310 Sequencers bei leichter Reduzierung der Laserleistung nicht beeinträchtigt (bzw. kann gegebenen Falls durch leichte Verlängerung der Injektionszeit vollständig kompensiert werden). Fragen Sie uns nach einem Set an Laufmodulen mit 6, 7 oder 8mW (statt den voreingestellten 9,9mW) Laserleistung passend für die bei Ihnen eingesetzte Version der 310 Data Collection Software. Ihr ABI 310 wird es Ihnen mit bis zu 50% verlängerter Lebensdauer des Lasers danken.
b.) "Laser Off" Modul: bei allen Nachfolgemodellen des ABI 310 wird der Laser nach abgearbeiteter Injektionsliste aus geschaltet. Beim ABI 310 dagegen wird der Laser lediglich in den Idle Zustand gesetzt, in dem er auf minimaler Leistung (ca. 1 bis 5mW) läuft, aber dennoch in Betrieb ist und ca. 400W elektrische Energie in unnötige Wärme und nicht genutztes Laserlicht umwandelt. Schließen Sie Ihre Injektionsliste mit einem unserer - für Ihre Version der 310 Data Collection Software passendem - "Laser Off" Modul ab und verlängern so die Gesamtlebensdauer Ihres ABI 310 Lasers und sparen gleichzeitig etliche Hundert Kilowattstunden Energie im Jahr.
c.) Unser eigenentwickelte 505nm LED Dioden-Laser schaltet sich nicht nur nach der letzten analysierten Probe automatisch ab, sondern spart pro Probe etwa 0,5kWh Strom. So zahlt sich der Laser über seine gesamte Lebensdauer von selbst ab.

Tipps zum
Verbrauchs-
material:

Weiterhin Originalreagenzien verwenden: Wegen der gemischten Erfahrung unserer Kunden, empfehlen wir eindeutig, keine alternativen Reagenzien, sondern weiterhin original Thermo Fisher Polymer und Puffer zu verwenden. Die Reagenzien der alternativen Hersteller wie Nimagen mit NimaPOP-4 / 6 / 7, MCLAB mit NanoPOP-4 / 6 / 7 , AdvancedSeq mit PwrPOP-4 / 6 / 7 oder SureFire Biosciences mit QuantumPOP-7 zusammen mit deren 10x Laufpuffer funktionieren zwar normalerweise gleichwertig - aber auch nicht besser - wie die original Thermo Fisher Reagenzien, verderben jedoch deutlich schneller am Gerät und führen dabei leider regelmäßig zu einer vorzeitigen Degeneration der Kapillare. Je nach Typ und Fluoreszenzfarbe sind auch Mobilitäts-Shifts von bis zu +/-1bp im Vergleich zu original Thermo Fisher Polymer, zu beobachten. Wir empfehlen daher all unseren ABI 310 Kunden, günstige POP-4 / 6 / 7 für ABI 3500 96-Sample Beutel (Thermo Fisher Bestellnummern A26070 / A26071 / A26073) zu kaufen, an einer der oberen Ecken aufschneiden und den gesamten Inhalt in ein sehr gründlich gereinigtes (auch neue!) Schraubgefäß umzufüllen und daraus bei Bedarf die 1ml Glasspritze zu befüllen. Chemisch identischer 10x Laufpuffer ist in 500ml Abfüllungen für ABI 3730 unter der Thermo Fisher Bestellnummer 4335613 erhältlich. Wenden Sie sich an uns für kleinere Abfüllungen. Den 10x Puffer vor jeder Entnahme vorsichtig aufschütteln, um eine gleichbleibende Konzentration zu gewährleisten. Den Puffer definitiv nicht länger als 1,5 Jahre nach dem Öffnen verwenden!
Kapillaren selbst herstellen: 100 Euro für ein 47 (P/N 402839) oder 61cm (P/N 402840) langes Stück Polyimid beschichtete Quarzglaskapillare erscheinen Ihnen zu viel? Dann machen Sie doch in Zukunft Ihre ABI 310 Kapillaren selbst. Mit den richtigen Werkzeugen von uns wird das Ablängen des Kapillarmaterials von der Rolle und das Platzieren eines Laserfensters an der richtigen Stelle zum Kinderspiel.
Gelblock nur halb mit Polymer füllen: Ursprünglich war der obere Schraubanschluß (im Englischen Luer Valve genannt) am Gelblock des ABI 310 dazu gedacht, neues Polymer aus einer Vorrats-Plastikspritze nach zu füllen. Wegen eintrocknendem Polymer im Inneren des Schraubanschlusses und wegen Problemen mit dem hohen benötigten Druck um den Stößel der Glasspritze aufwärts zu drücken, hat sich diese Nachfüllmethode nicht durchgesetzt - als Relikt sind der "Gel Pump"-Knopf am Sequencer und der "Gel Pump Fill"-Wizard in der Data Collection Software übrig geblieben. Nutzen Sie doch die Tatsache, dass der Schraubanschluß vorhanden ist, um ca. 60µl Polymer beim Befüllen des Gelblocks (P/N 4303520, auch als Polymerblock oder Pump Block bezeichnet) zu sparen. Anstatt alle Kanäle des Blocks mit Polymer aus der Glasspritze zu befüllen, kann alternativ nur die rechte Hälfte des Blocks bis zum Ansatzpunkt des oberen Schraubanschlusses mit Polymer befüllt und ab dort mit 1x Buffer aus einer temporär am Schraubanschluß aufgesteckten 2-5ml Plastikspritze weiter gefüllt werden. Das Polymer hat in den Kanälen des Gelblocks nur die Aufgabe, Strom bzw. Ionen zu leiten und für diese Funktion ist 1x Puffer dauerhaft genauso geeignet.
Haltbarkeit von Polymer und Puffer am Gerät: Unter normalen Bedingungen (niedrige Raumtemperatur und innerhalb des Haltbarkeitsdatums) ist das Polymer (POP® = Performance Optimised Polymer) statt der von Applied Biosystems veranschlagten einen Woche, typischerweise 2-4 Wochen in der Spritze am Sequencer haltbar. Erst danach lässt die Auftrenn- oder die Injektionsleistung nach und das Polymer muss ausgetauscht werden. Der 1x Laufpuffer mit EDTA ist ebenfalls deutlich länger als die empfohlenen 24 Stunden haltbar. Je nach Einsatz des Sequencers kann der Puffer 3-14 Tage ohne negative Effekte verwendet werden. Wichtig: beim Puffertausch die Gefäße gut reinigen und vor allem da Glasgefäß anschließend außen abwischen und trocknen, um Spannungsüberschläge am Autosampler zu vermeiden. Alle 3-6 Monate empfiehlt es sich aufgrund nachlassender Isolationsfähigkeit, das Glasgefäß (P/N 401955) gegen ein neues aus zu tauschen. Der Gelblock muss nur dann komplett gereinigt werden, wenn zuvor Probleme mit gealtertem Polymer aufgetreten sind - ansonsten kann der Gelblock mit neu befüllter Glasspritze weiter verwendet werden (gegebenen Falls etwas frisches Polymer durch die Kanäle des Blocks drücken, um das alte Polymer zu ersetzen).
Polymerverbrauch minimieren: Für die Sparsamen unter den ABI 310 Anwendern besteht die Möglichkeit den Polymerverbrauch pro Injektion über ein Herabsetzen der Gel Pump Force oder ein Verkürzen der Pumpzeiten in den Modulen zu verringern ohne daß Einbußen bei der Trennleistung entstehen. Das Innenvolumen einer 47cm Kapillare liegt bei 0,9µl, das einer 61cm Kapillare bei 1,2µl. Etwa das doppelte bis dreifache Volumen an Polymer müssen durch die Kapillare gepumpt werden, um anschließend eine einwandfreie Auftrennung der Fragmente zu gewährleisten. Typischerweise wird die Gel Pump Force von Servicetechnikern von Applied Biosystems so eingestellt, daß etwa 8lbs Kraft auf den Spritzenstößel wirken. 6bls sind nach unserer Erfahrung jedoch immer ausreichend für eine gute Füllung der Kapillaren. Entscheidend für einen niedrigen Polymerverbrauch (messbar z.B. an den Unterschieden der "syringe"-Positionen in der log Datei einer Laufserie) ist auch die Minimierung aller Luftblasen im System: je kleiner die Luftblasen in den toten Enden der Gelblockkanäle und unter dem Stößel der Glasspritze, desto geringer ist der Ausstoß von Polymer in das Anoden-Puffergefäß beim Entspannen des Gelfüllsystems nach dem Öffnen des Buffer Valves.
Gummisepta weg lassen oder wiederverwenden: Beim Einsatz nicht-wässriger Probenmedien (z.B PCR-Ansätze in HiDi-Formamid oder Reinigungssäulenelution mit HiDi-Formamid) kann vollständig auf das Verschließen der 0,5ml Probengefäße mit Septadeckeln verzichtet werden. Die tolerable Verdampfungszeit wässriger Probenmedien liegt je nach Raumtemperatur bei 6-12 Stunden. Bei Verwendung von Septadeckeln können die einzelnen Septadeckel der 0,5ml Probengefäße oder die Septastreifen der 0,2ml Gefäße ohne Kontaminationsgefahr vielfach für die nachfolgenden Laufproben wiederverwendet werden, wenn sie nach der Verwendung in Wasser oder einer stark verdünnten Seifenlösung eingelegt und bei Gelegenheit gut mechanisch gespühlt, mit demineralisiertem Wasser gereinigt und anschließend getrocknet werden.
Luftfilter selbst reinigen: Obwohl der Luftfilter beim ABI 310 sehr großzügig ausgelegt ist, empfiehlt es sich diesen etwa einmal im Jahr aus zu tauschen, bzw. mit gutem Erfolg per Staubsauger zu reinigen. Zum Entnehmen des Luftfilters öffnet man bei ausgeschaltetem Sequencer beide Türen und klappt die untere Gehäuseabdeckung (mit Statusanzeige und Gerätebezeichnung) vorne nach oben. Beim Ablegen der Gehäuseabdeckung auf die bestehende Kabelverbindung der Statusampel achten. Danach den Luftfilter herausziehen, auf der verstaubten, unteren Seite gut absaugen und in gleicher Orientierung (Lochblech oben bzw. auf die aufgedruckte Pfeilrichtung des Luftdurchsatzes achten) wieder einbauen. Danach die Gehäuseabdeckung wieder montieren.
BigDye® Terminator verdünnen: Den BigDye® Terminator v1.1 oder v3.1 Cycle Sequencing Mastermix in den von Applied Biosystems empfohlenen Mengen im PCR-Ansatz zu verwenden, wäre für kein Labor wirtschaftlich. Der Mastermix aus Sequencing PCR Puffer, dNTPs und farbigen ddNTPs kann bei Optimierung der Primermenge, der Template DNA Konzentration, der Template DNA Reinheit, den PCR Zykluszahlen und der Aufreinigungsmethode zwischen 1:4 und ca. 1:32 verdünnt werden, wenn die verminderte Pufferkapazität des BigDye® Mastermixes durch den Zusatz von ABI 5x Sequencing Buffer(P/N 4336697) oder eines eigenen PCR Puffers (5x: 400mM Tris-HCl pH9, 10mM MgCl2) ersetzt wird. Seit Mitte 2008 hat Applied Biosystems jedoch im Zuge einer "Optimierung" des BigDye® Mastermixes die Konzentrationen der dNTPs und farbigen ddNTPs herab gesetzt, so daß mit den zuvor gewohnten hohe Verdünnungen möglicherweise nicht mehr ausreichende Sequenzierergebnisse erreicht werden und eine etwas geringere Verdünnungsstufe gewählt werden muß. Typisch funktioniert 0,2 bis 0,5µl BigDye Mastermix auf 10µl PCR-Gesamtvolumen zuverlässig.
Glasspritze reparieren: Mit etwas Geschick kann eine über die Monate undicht gewordene Kloehn (P/N 4304471), ILS (P/N 2618012) oder Hamilton 1ml Glasspritze wieder für einige Zeit dicht bekommen werden. Dazu den Stößel langsam ganz aus dem Glaskörper heraus ziehen, die Einzelteile gut reinigen und anschließend den Stößel mit dem Teflonende nach unten exakt senkrecht auf eine ebene Fläche (z.B. eine Glasplatte) stellen und gefühlvoll, aber nicht zu zaghaft mit einigen gezielten Hammerschlägen die Teflondichtung mechanisch aufweiten. Wer sich der Reibungskraft des Stößels in einer neuen Glasspritze bewusst ist, wird erfühlen können, ob die bearbeitete Teflonspitze genügend aufgeweitet wurde. Spätestens beim Einsatz der reparierten Spritze stellt sich heraus, ob die Bearbeitung der Teflondichtung ein Erfolg war. Das Überschichten des Teflonstößels einer fertig befüllten Spritze mit etwas demineralisiertem Wasser verhindert, daß leckendes und zu Kristallen eingetrocknetes Polymer den Teflonteil des Stößels mehr als nötig beansprucht. Wenn sich die Teflondichtung nicht mehr zuverlässig abdichten lässt, fragen sie uns nach einer Ersatz-Dichtung oder einer überarbeiteten Glasspritze im austausch
Verbogene Elektrode reparieren: Eine durch einen Anwenderfehler oder eine Fehlfunktion des Sequencers verbogene Platinelektrode muß nicht unbedingt durch eine neue ersetzt werden. Nachdem sie grob wieder gerade gebogen wurde kann der letzte Feinschliff gut durch Rollen der Elektrode zwischen einer Glasplatte oder auch Glasspritze und einer nicht ganz glatten Oberfläche (z.B. die Laborbank) erfolgen. Danach die Elektrode gut mit Ethanol oder Isopropanol reinigen.
Neue Matrix nach Wartung oder Lasertausch sparen: Nach dem Austausch Ihres ausgebrannten ABI 310 Lasers oder nach einer ausführlichen Wartung inklusive Laserjustage durch uns müssen Sie in 90% der Fälle keine neue Matrixkalibrierung für die verwenderen Farbfilter (auch DyeSets genannt) durchführen. Wir achten beim Einstellen des Laser drauf, daß Sie Ihre bisherigen Matrixdateien und Einstellungen beibehalten können.
Matrixdateien ohne Matrix-Reagenzien erstellen: Am ABI 310 besteht die Möglichkeit, Matrixdateien aus den Rohdaten normaler Probenläufe zu erstellen und so auf den Kauf von Matrix-Kits zu verzichten: Für die spektrale Kalibrierung der BigDye v1.1 oder v3.1 Fluoreszenzfarbstoffe im Modul E benötigt man hierzu nur eine qualitativ hochwertige Sequenzierreaktion mit langer Leseweite. Bewährt hat sich hierfür ein Ansatz mit dem im BigDye Kit mitgelieferten Kontrolltemplate pGEM-3Zf(+) (0,5µl) und dem Kontrollprimer -21 M13 forward (2µl), der nach der PCR Amplifikation wie normale Sequenzierproben aufgereinigt wird - im Prinzip funktioniert die Erstellung einer BigDye Matrix mit jeder beliebigen Sequenzierreaktion, die >500bp Leseweite hat. Die "Make Matrix" Funktion in der Sequenzing Analysis Software erlaubt auch die Auswahl nur einer einzigen Laufdatei (statt der vier einzelnen Läufe mit nur je einer Sequenzierfarbe aus dem Matrixkit). Mit Sequenzierrohdaten eines POP-6 Laufes funktioniert die Erstellung einer Matrix normalerweise ohne Fehlermeldung des Matrixmakers. Bei Pop-4 Läufen kommt der Algorithmus jedoch häufig nicht mit der geringeren Auftrennung (kürzeres Spacing) der Sequenzierfragmente zurecht, so daß man als Ausweg bei Verwendung von POP-4 nur ein deutliches Herabsetzen der Laufspannung für die Erzeugung der Rohdaten des Matrixlaufes versuchen kann. Bei der spektralen Kalibrierung für 4- oder 5-Farben Fragmentanalyse Farbsets erwartet der "Matrix Maker" aus GeneScan oder GeneMapper eine manuelle Bereichsauswahl (über individuelle Start Points und gemeinsame Readlength Points) innerhalb der Matrix-Kit-Läufe, in denen jeweils mehrere Peaks mittlerer Intensität (ca. 1.000 bis 4.000 RFU) einer einzigen Farbe enthalten sind. Nach unserer einschlägigen Erfahrung macht es jedoch keinen Unterschied, ob die Matrix über Abschnitte innerhalb dieser Läufe errechnet wurde, in denen mehrer gleichfarbige Peaks oder auch nur ein einziger Peak enthalten ist (Mehrkapillarsequencer erstellen die spektrale Kalibrierung immer nur aus einem Peak je Farbe). Daher kann auch eine einzige Laufdatei zur Matrixerstellung verwendet werden, in der je ein (oder zwei) Peak(s) aller vorkommenden Farben in einem Umfeld von mindestens 200 Scans (= minimale Readlength Points Anzahl) keine andersfarbigen Peaks enthält. Möglicherweise muß dazu eine typische Probe auch einmal ohne internen Längenstandard aufgetragen werden und anschließend der Standard als eigene Probe. Falls Sie jedoch eigene Primer oder Kits verwenden, in denen nicht alle Farben eines DyeSets verwendet werden, müssen Sie auf die Erstellung der Matrix aus einzelnen Läufen des Matrix-Kits zurück greifen. Mit den erstellten Matrixdateien können auch Proben ausgewertet werden, deren Peaks außerhalb der optimalen Intensitätsbereiche (ca. 200 bis 2.000 RFUs bei Sequenzierreaktionen bzw. 200-4.000 RFUs bei Fragmentanalysen) liegen. Übersteuerte Offscale Peaks erzeugen prinzipbedingt immer "Durchschläge" in die anderen Farbkanäle.

Tipps zur
Software:

Datenübertragung vom MAC auf den PC: Neben der häufig genutzen Möglichkeit, Sequenzierdateien oder Fragmentanalysedateien die auf einem MAC OS System erstellt wurden über ein 100MB Iomega Zip Laufwerk auf einen benachbarten Windows PC zu übertragen, besteht ab MAC OS 8.5 die einfache Möglichkeit (MAC OS kompatible) USB-Memory Sticks zum Datenaustausch zu verwenden. Fragen Sie uns nach MAC fähigen PCI-USB-Schnittstellenkarten für Ihren Power MAC oder MAC G3 ohne eingebaute USB Schnittstelle. Im einem TCP/IP Netzwerk besteht weiterhin die Möglichkeit, über einen einfachen FTP-Server und einen FTP Client (z.B. Fetch FTP Client) für MAC OS oder über aktiviertes Websharing am MAC die Dateien auf einen PC herunter zu laden. Am PC angekommen müssen die Dateien nur um die fehlende Dateiendung .ab1 bei Sequenzierdateien bzw. um die Dateiendung .fsa bei Fragmentanalysedateien ergänzt zu werden, falls Sie nicht bereits am MAC über ein MAC to PC Konvertierungs-Script vorbereitet wurden.
Fehlerfreieres Basecalling: Versuchen Sie doch einmal alternativ zum Basecalling von Sequenzierrohdaten über die verschiedenen Basecaller oder den KB (KiloBase) Basecaller Algorithmus der Sequencing Analysis Software ihre Sequenzabfolge auch über den PeakTrace Basecaller von Nucleics neu auswerten zu lassen. Nach unserer Erfahrung korrigiert der Basecaller von Nucleics so gut wie alle Fehlinterpretationen der ABI Basecaller, die bei einer manuellen Nachkorrektur auffallen.
Passwörter zurück setzen: Sie haben das Kennwort (Passwort, engl. Password) zum Login (engl. User Name) für die Sequencing Analysis Software v5.1, v5.2 oder v5.3 vergessen oder das aktuelle Passwort funktioniert nicht mehr und Sie wollen es zurück setzen? Die Sequencing Analysis Software läßt sich nicht mehr starten? In diesen Fällen muß nicht die komplette Software deinstalliert, erneut installiert und anschließend wieder eingerichtet werden, sondern es reicht aus, die Datei "Sequencing Analysis Resources" im Installationsverziechnis (typisch D:\Applied Biosystems\SeqA...) zu löschen (oder um zu bennenen). Bei einem Neustart der Sequencing Analysis Software müssen nun erneut die Registrierungangaben eingegeben und ein Benutzername und dessen Kennwort festgelegt werden. Nur ein kleiner Teil der Konfigurationseinstellungen wird dabei zurück gesetzt. Das gleiche Vorgehen funktioniert auch mit der SeqScape Software v2.1.1 oder v2.5. Dort muß die Datei "SeqScape Resources" gelöscht oder umbenannt werden. Beim Zurücksetzen des Kennworts für eine GeneMapper ID v3.1, ID v3.2 oder v4.0 Installation ist der Zugriff auf die dahinterliegende Oracle Datenbank nötig. Fragen Sie uns, wenn Sie ein Problem mit Ihrer GeneMapper Installation oder dem Login haben.

ABI PRISM®, POP, HiDi-Formamide und BigDye® sind eingetragene Markenzeichen der Applera Corporation oder ihrer Tochterunternehmen in den USA und weiteren Ländern.

Gebrauchter ABI PRISM® 310 DNA Sequencer

Technische Daten ABI 310

Tipps und Tricks