ABI PRISM® 3100-Avant / ABI 3100 Genetic Analyzer zu verkaufen - DNA Sequencer mit neuem Laser, Garantie, Installation und Service

Technische Daten ABI 3100-Avant / ABI 3100

Übersicht:

Der ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer ist ein 4-Kapillarsequencer, der ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer ein 16-Kapillarsequencer zur vollautomatischen Abarbeitung von je 4 bzw. 16 gleichartigen Proben innerhalb einer 96-Well oder 384-Well PCR Platte. Der Autosampler des ABI 3100Avant kann eine, der des ABI3100 zwei per Gummiseptamatten versiegelter Probenplatten aufnehmen. Fertige 4-fach bzw. 16-fach Kapillararrays sind mit den Auftrennstrecken zwischen 22cm und 80cm verfügbar und werden offiziell mit den gelartigen Fertigpolymeren POP-4 oder POP-6 (POP® = Performance Optimised Polymer) und nach Modifikation der Software auch POP-7 sowohl für die Sequenzierung als auch Fragmentanalyse eingesetzt. Aus der Kombination der Trennstreckenlänge mit einem der Polymere und einer über Laufmodule festgesetzten Elektrophoresespannung und Temperierung der Kapillarheizung ergeben sich Laufbedingungen die zu sehr schnellen Läufen jedoch mit geringerer Leseweite / Auftrennleistung, zu mittleren Bedingungen oder zu längeren Laufzeiten mit sehr guten Trennleistungen / Leseweiten >= 1000 bp führen. Die Detektion der mit bis zu 5 verschiedenen Fluoreszenzfarbstoff markierten Fragmente erfolgt durch Anregung der Farbstoffe über zwei fokussierte Argon Laserstrahlen und die Erfassung der Emission nach spektraler Aufspaltung mit einer hochauflösende CCD Kamera. Mit Hilfe der anwendungsspezifischen Auswertesoftware werden die detektierten Emissionspeaks in eine Sequenzabfolge (Basecalling) übersetzt oder an Hand eines intern mitgeführten Längenstandards tabellarisch als errechnete Fragmentlängen in bp ausgegeben (Sizecalling). Optional werden die Fragmentgrößen auch automatisch als vorab definierte Allele interpretiert (Genotyping / Alleling).

Haupt-
merkmale:

Vollautomatischer Kapillarelektrophorese (engl. CE = capillary electrophoresis) Sequencer mit 4 oder 16 Kapillaren und Auftrennstrecken von 22cm, 36cm, 50cm oder 80cm
Autosamplerkapazität für eine (ABI 3100-Avant) bzw. zwei in speziellen Racks eingespannte 96-Well oder 384-Well PCR Platten (mit einer Gummiseptamatte verschlossen) mit je einem Probenvolumen von mind. 10µl (bzw. 5ul)
Ein bei 15mW betriebener 25mW MultiLine Argon Ionen Laser (JDS Uniphase 2211D-25MLHCH bzw. Showa GLG3078) mit den Hauptwellenlängen 488nm (blau) und 514,5nm (blau-grün) zur Anregung der Fluoresenfarbstoffe
Virtuelle Filter für beliebige, spektral ausreichend getrennte 4 (blau, grün, gelb, rot) oder 5 (blau, grün, gelb, rot, orange) Farbkanäle zur Messung von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Fragmenten im Emissionsbereich von 500 bis 700nm
Auftrennung von Fragmenten zwischen 10 und ca. 1.200bp
Elektrophoresespannung 100V bis 15kV, Spannung und -strom werden während eines Laufs protokolliert
Geregelte Kapillarheizung mit einem Temperaturbereich 10°C über RT bis 65°C, typischerweise 50°C für Sequenzierungen bzw. 60°C für Fragmentanalysen
Trennmedium POP4 oder POP6 und nach Erweiterung der Software auch POP-7 in der 5ml Vorrats- (engl. Polymer Reserve Syringe) bzw. 250µl Füllspritze (engl. Array Fill Syringe) von Kloehn, Hamilton oder ILS mit automatischer Neubefüllung der Kapillaren vor jedem Lauf
Laufzeiten ca. 20 bis 150 Minuten, je nach Anforderung an Auftrennleistung und Leseweite

PC / Software:

Bewährte spezielle Dell PC Modelle mit mind. 1GB Hauptspeicher, eine oder zwei große Festplatten (4 Partitionen), On-Board Netzwerkanbindung zum Sequencer und Anbindung zum LAN über eine zusätzliche PCI Netzwerkkarte, USB, CD / DVD Laufwerk, Micosoft Windows® NT SP6a oder Windows® 2000 SP4
ABI 3100-Avant bzw. ABI 3100 Data Collection Software v1.x unter Windows® NT oder v2.0 unter Windows® 2000
Sequencing Analysis Software zum Identifizieren der Basenabfolge als Version v3.7 für Windows® NT oder v5.1.1 für Windows® 2000 mit dem aktuellen KB basecaller (Kilo Base basecaller) zur Angabe der Quality Value Werte entsprechend der Sicherheit der identifizierten Basenabfolge. Optional kann auch die Sequenzvergleich / SNP-Identifizierungs Software SeqScape v2.1.1 oder v2.5 direkt auf dem Sequencersteuer PC installiert und SeqScape Läufe aus der Data Collection Software v2.0 heraus vorbereitet werden.
GeneScan zur Größenbestimmung der Fragmentpeaks anhand des internen Größenstandards als Version v3.7 unter Windows® NT (oder unter Windows® 2000 mit RAM-Begrenzung auf 512MB) zusammen mit GenoTyper zur Zuordnung der Fragmentgrößen in vordefinierte Allele. GeneMapper v3.x oder v4.0 für Windows® 2000 zur gleichtzeitigen Größenbestimmung und Allelzuordnung sowie die für die bei der Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks (Forensik, Vaterschaftstest, Verwandschaftsgrade, Artenvielfalt, ...) benutzten Mikrosatellitenmarker optimierte GeneMapper Version ID v3.1 / v3.2
ABI 3100 Series Service Tool Software als v1.0 oder v3.0 zur Überprüfung einzelner Gerätekomponenten auf Ihre einwandfreie Funktion innerhalb der vorgegebenen Spezifikationen, zur manuellen Ansteuerung aller Einzelkomponenten und hilfreich bei der Fehlersuche. Eigentlich für den Servicetechniker gedacht, können einfache Diagnosefunktionen jedoch auch vom Endanwender ausgeführt werden.

Technische Daten:

Abmessungen Sequencer: Breite 74cm x Tiefe 54cm x Höhe 80cm. Minimaler Platzbedarf auf der Laborbank: Breite 115cm x Tiefe 60cm x Höhe 80cm. Gewicht: ca. 110kg (2 starke Personen zum Aufstellen)
Elektrischer Anschluß: Sequenzer über 16A oder 32A blaue 1-Phasen CEE Stecker über eine eigene Leitung von der Elektroverteilung (zur Vermeidung von stöhrenden Einflüssen anderer Verbraucher im selben Stromkreis); PC und TFT Bildschirm über Eurostecker. Unterbrechungsfreie Stromversorgung (USV) zu Absicherung gegen Überspannung und Stromausfälle wird empfohlen in Gebieten mit bekannten Stromschwankungen. Elektrische Leistung PC und TFT ca. 150W, Sequencer mit ausgeschaltetem Laser ca. 300W, Sequencer im Betrieb ca. 800-1.400W. Eine aktive Klimatisierung wird für kleine Laborräume empfohlen.

Tipps und Tricks

Tipps zum
Sequencer:

Autosampler-Kalibrierung: Bei den Mehrkapillarsequencern ist eine Kalibrierung des Autosamplers durch den Endanwender normalerweise nicht notwendig. Bei zu knapp über den Böden der 96er oder 384er PCR-Platten eingestellter Kalibrierung kann es jedoch im Laufe der Zeit dazu kommen, daß einzelne Kapillaren dauerhaft nicht mehr richtig injizieren, weil einzelne Kapillarenden am Boden aufsitzen. Dies ist häufig bei den äußeren Kapillaren (1 oder 4 am ABI 3100-Avant bzw. 1+2 oder 15+16 am ABI 3100) zuerst der Fall. Zur Behebung der Injektionsprobleme kann entweder manuell die Z-Höhen-Kalibrierung des Autosamplers in der 3104Calib.ini bzw. 3100Calib.ini Datei herab gesetzt werden oder eine komplett neue Kalibrierung durch Ausführung des "Autosampler Calibration Wizard" vorgenommen werden. Dabei müssen jedoch alle vorgegebenen Schritte genauestens befolgt, beim Schritt des Einlegens eines leeren Pufferreservoirs keinesfalls der Autosampler bewegt (gilt nur für die Data Collection Software v2.0) und außerdem bei der Höhenkalibrierung (abweichend zur Anleitung) etwa 0,75-1mm Abstand zwischen Kapillarenden und Füllhöhenmarkierung zugegeben werden.
Lebensdauer des Argon Lasers optimieren: Die Lebensdauer der auf 15mW betriebenen 25mW Argon Ionen Laser (JDS Uniphase 2211D-25MLHCH bzw. in neueren Modellen ab Ende 2003 / Anfang 2004 Showa GLG3078) in den 4- und 16-Kapillarsequencern ist mit 2 bis 5 Jahren in einem akzeptablen Bereich, kann jedoch durch Reduzierung der Laserleistung auf z.B. 12mW noch einmal verlängert werden. Nach einer kleinen Softwaremodifikation kann die Laserleistung in den Laufmodulen als zusätzlicher Parameter eingesehen und verändert werden.

Tipps zum
Verbrauchs-
material:

Haltbarkeit von Polymer und Puffer am Gerät: Unter normalen Bedingungen (Raumtemperatur dauerhaft unter 25°C und keine abgelaufene Polymercharge) ist das POP (Performance Optimised Polymer) Polymer statt der von Applied Biosystems veranschlagten einen Woche, typischerweise 2-4 Wochen in den Spritzen am Sequencer haltbar. Erst danach läßt die Auftrenn- oder die Injektionsleistung nach und das Polymer muß ausgetauscht werden. Der obere (P/N 628-33743) und untere (P/N 628-3680) Gelblock sollten nur dann komplett gereinigt werden, wenn zuvor Probleme mit gealtertem Polymer aufgetreten sind - ansonsten können sie mit neu befüllten Glasspritzen weiter verwendet werden. Der 1x Laufpuffer mit EDTA ist ebenfalls deutlich länger als die empfohlenen 24 Stunden haltbar. Je nach Einsatz des Sequencers kann der Puffer 3 bis 10 Tage ohne negative Effekte verwendet werden. Wichtig: beim Puffertausch die Gefäße gut reinigen, damit auch ein sich möglicherweise abgesetzter Film (der häufig für eine sich während des Laufes ändernde blaue Grundlinie verantwortlich ist) an den Gefäßinnenseiten entfernt wird.
Septamatten wiederverwenden: Aus Erfahrung vieler unsere Kunden können die Gummiseptamatten der 96-Well (P/N 4315933) oder 384-Well (P/N 4315934) Platten ohne Kontaminationsgefahr für die nachfolgenden Laufproben wiederverwendet werden, wenn sie nach dem Einsatz in Wasser oder einer stark verdünnten Seifenlösung eingelegt und bei Gelegenheit gut mechanisch gespühlt, mit demineralisiertem Wasser gereinigt und anschließend getrocknet werden.
Luftfilter selbst reinigen: Der Luftfilter (P/N 628-3101) der Vier- und Sechzehn-Kapillarsequencer ist relativ klein dimensioniert, weshalb es sich empfiehlt ihn alle 6 Monate aus zu tauschen oder einfach und effektiv per Staubsauger zu reinigen. Alternativ kann das schwarze Filtermaterial auch aus dem Kartonrahmen entnommen und mit Seifenwasser gespült werden. So weit sich nach dem Reinigen noch Staubreste auf einer Filterseite befinden solten, muß beim Wiedereinbau auf die Beibehaltung der bisherigen Orientierung des Filter bezüglich Eintritts- und Austrittsseite geachtet werden.
Lebensdauer des Kapillar-Arrays verlängern: Um die 4- bzw. 16-Kapillar-Arrays mehr als die typischen 500 bis 1.000 Läufe ohne größere Qualitätseinbußen einsetzen zu können, empfiehlt es sich gelegentlich (z.B. einmal täglich oder nach jeder Laufserie) entweder die Kapillaren über den "Fill Array Wizard" mit frischem Polymer befüllen zu lasen oder einen Reinigungslauf mit 4 bzw. 16 HiDi®-Formamid Proben über ein beliebiges Sequenzier oder Fragmentanalyse Modul durch zu führen. Diese beiden Array-Reinigungsmethoden haben sich auch bewährt, um eine einwandfreie Qualität bereits des ersten Sequenzierlaufes nach einer Fragmentnanlyse-Serie zu gewährleisten.
BigDye® Terminator verdünnen: Den BigDye® Terminator v1.1 oder v3.1 Cycle Sequencing Mastermix in den von Applied Biosystems empfohlenen Mengen im PCR-Ansatz zu verwenden, wäre für kein Labor wirtschaftlich. Der Mastermix aus Sequencing PCR Puffer, dNTPs und farbigen ddNTPs kann bei Optimierung der Primermenge, der Template DNA Konzentration, der Template DNA Reinheit, den PCR Zykluszahlen und der Aufreinigungsmethode zwischen 1:4 und ca. 1:32 verdünnt werden, wenn die verminderte Pufferkapazität des BigDye® Mastermixes durch den Zusatz von ABI 5x Sequencing Buffer (P/N 4336697) oder eines eigenen PCR Puffers (10x: 400mM Tris-HCl pH9, 10mM MgCl2) ersetzt wird. Seit ca. 2008 hat Applied Biosystems jedoch im Zuge einer "Optimierung" des BigDye® Mastermixes die Konzentrationen der dNTPs und farbigen ddNTPs herab gesetzt, so daß mit den zuvor gewohnten hohe Verdünnungen möglicherweise nicht mehr ausreichende Sequenzierergebnisse erreicht wurden.
Alternative Sequencer Reagenzien und Verbrauchsmaterialien: Neben den original 96-well Platten mit Rand von Applied Biosystems (P/N N801-0560), sind von diversen Herstellern (u.a. 4titude, Axygen, Kisker Biotech) baugleiche Platten mit fast exakt gleicher well-Tiefe erhältlich, die sich im täglichen Betrieb als einwandfrei erwiesen haben. Prinzipiell funktionieren auch einfache 96-well PCR Platten ohne Rand. Als Alternative zum 10x Running Buffer von Applied Biosystems (in der 25ml P/N 402824 oder 500ml Abfüllung P/N 4335613) empfiehlt sich der hervorragend bewährte und 12 Monate haltbare, günstige Laufpuffer von Sigma-Aldrich B4930-1L oder das eigene Ansetzen des Puffers (10x buffer: 1M TAPS, pH8 mit NaOH, 10mM EDTA). Auf aliquotiertes, eingefrohrenes original Applied Biosystems HiDi®-Formamide (P/N 4311320) sollte man jedoch nicht verzichten, um störende Ionen in den Proben zu minimieren. Als Alternative zu POP-4 (P/N 4316355), POP-6 (P/N 4316357) und nach Softwaremodifikation auch POP-7 (P/N 4352759) kann mit etwas Vorsicht und geringerer Haltbarkeit (am Gerät) auch JAZ-4, JAZ-6 oder JAZ-7 von Carolina BioSystems sowie (je nach Charge nicht wie beworben etwas schärfer sondern zum Teil auch etwas schlechter auftrennend als POP-4 / POP-6 / POP-7 von Applied Biosytems) NanoPOP-4 / NanoPOP-6 / NanoPOP-7 von MCLAB eingesetzt werden. Eine preisliche Alternative stellt auch POP-7 in der 25 oder 28ml Abfüllung für ABI 3730 dar (P/N 4363929), soweit die Haltbarkeit der großen Menge bei geringem Verbrauch nicht zum Problem wird. Fragen Sie uns nach einer günstigen Bezugsquelle.
Glasspritze reparieren: Mit etwas Geschick kann eine über die Monate undicht gewordene 250µl Kloehn (P/N 4304470), Hamilton oder ILS (P/N 2618812) Glasspritze wieder für einige Zeit dicht bekommen werden. Dazu den Stößel langsam ganz aus dem Glaskörper heraus ziehen, die Einzelteile gut reinigen und anschließend den Stößel mit dem Teflonende nach unten exakt senkrecht auf eine ebene Fläche (z.B. eine Glasplatte) aufstellen und gefühlvoll, aber nicht zu zaghaft mit einigen gezielten Hammerschlägen die Teflondichtung mechanisch aufweiten. Wer sich der Reibungskraft des Stößels in einer neuen Glasspritze bewust ist, wird erfühlen können, ob die bearbeitete Teflonspitze genügend aufgeweitet wurde. Spätestens bei einer Testfüllung (mit Wasser oder Polymer) stellt sich heraus, ob die Bearbeitung der Teflondichtung ein Erfolg war.
Neue spektrale Kalibrierung nach Wartung oder Lasertausch vermeiden: Nach dem Austausch Ihres ausgebrannten JDSU oder Showa Lasers oder nach einer ausführlichen Wartung inklusive Laserjustage durch uns müssen Sie in 95% der Fälle keine neue spektrale Kalibrierung (engl. spectral calibration) für die verwenderen Farbfilter (auch DyeSets) durchführen. Wir achten beim Einstellen des Laser drauf, daß Sie Ihre bisherigen Kalibrierungen beibehalten können.

Tipps zur
Software:

Zusätzliche DyeSets: Speziell beim Einsatz von Testkits verschiedener Hersteller, die alle das G5 (=DS-33) DyeSet zur spektralen Trennung ihrer fünf Fluorestenzfarbstoffe empfehlen, entsteht die Notwendigkeit vor den Läufen der einzelnen Testkits, die spektrale Kalibrierung des G5 Farbfilters auf die zum Kit passende Kalibrierung um zu stellen, so daß mehrere Kits (auf der gleichen Platte) nicht automatisch hintereinander abgearbeitet werden können. Neben der Möglichkeit für einen der Kits das Any5Dye Farbset zu verwenden (beim Any5Dye Farbfilterset ist das spektrale Binning nicht auf die im G5 Set von Applied Biosystems eingesetzten Farben 6-FAM, VIC, NED, PET und LIZ oder deren Analoga, z.B. FAM, Yakima Yellow, ATTO 550, ATTO 565 und ATTO 633 von MWG optimiert, sondern wie bei allen 4-Farb DyeSets gleichmäßig verteilt und daher etwas anfälliger für das Durchschlagen hoher Peaks in den falschen Farbkanal), können zusätzliche DyeSets auf Basis des G5-Binnings importiert werden.
Fehlerfreieres Basecalling: Versuchen Sie doch einmal alternativ zum Basecalling von Sequenzierrohdaten über die verschiedenen Basecaller oder den KB (KiloBase) Basecaller Algorithmus der Sequencing Analysis Software ihre Sequenzabfolge über den PeakTrace Basecaller von Nucleics neu auswerten zu lassen. Nach unserer Erfahrung korrigiert der Basecaller von Nucleics so gut wie alle Fehlinterpretationen der ABI Basecaller, die bei einer manuellen Nachkorrektur auffallen. Bis zu 10 Basecalls pro Tag sind bei Nucleics kostenlos.
Passwörter zurück setzen: Sie haben das Kennwort (Passwort, engl. Password) zum Login (engl. User Name) für die Sequencing Analysis Software v5.1, oder v5.1.1 vergessen oder das aktuelle Passwort funktioniert nicht mehr und Sie wollen es zurück setzen? Die Sequencing Analysis Software läßt sich nicht mehr starten? In diesen Fällen muß nicht die komplette Software deinstalliert, erneut installiert und anschließend wieder eingerichtet werden, sondern es reicht aus, die Datei "Sequencing Analysis Resources" im Installationsverziechnis (typisch D:\Applied Biosystems\SeqA...) zu löschen (oder um zu bennenen). Bei einem Neustart der Sequencing Analysis Software müssen nun erneut die Registrierungangaben eingegeben und ein Benutzername und dessen Kennwort festgelegt werden. Nur ein kleiner Teil der Konfigurationseinstellungen wird dabei zurück gesetzt. Das gleiche Vorgehen funktioniert auch mit der SeqScape Software v2.1.1 oder v2.5. Dort muß die Datei "SeqScape Resources" gelöscht oder umbenannt werden. Beim Zurücksetzen des Kennworts für eine GeneMapper ID v3.1, ID v3.2, v3.5, v3.7 oder v4.0 Installation ist der Zugriff auf die dahinterliegende Oracle Datenbank nötig. Fragen Sie uns, wenn Sie ein Problem mit Ihrer GeneMapper Installation oder dem Login haben.

ABI PRISM®, POP, HiDi-Formamide und BigDye® sind eingetragene Markenzeichen der Applera Corporation oder ihrer Tochterunternehmen in den USA und weiteren Ländern.

Gebrauchter ABI PRISM® 3100-Avant / ABI 3100 DNA Sequencer

Technische Daten ABI 3100-Avant / ABI 3100

Tipps und Tricks